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哺乳動物代謝氫氣的同位素研究證據!

文章來源:孫學軍 氫思語發布日期:2021-04-22 17:46瀏覽次數:
  內容僅限于知識科普,不代表對本公司產品的宣傳。
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這是一項是關于氚標記方法示蹤哺乳動物細胞代謝氫氣的研究,1953年發表在ARCH BIOCHEM ANDBIOPHYS,論文作者Grant N. Smith(格蘭特·史密斯)等來自美國通用電氣公司放射生物學部。
 

Smith G N , Emerson R J , Temple L A , et al. The oxidation of molecular tritium in mammals[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1953, 46(1):22-30.
 

氫氣生物學效應研究,今天已經受到廣泛關注。但氫氣在動物和人體內的代謝仍然存在疑問,這非常不利于對氫氣生物學效應的全面理解。這一沉寂的歷史文獻,從放射性標記角度,給出了關于哺乳動物細胞代謝氫氣的重要線索,非常值得重視。由于這一研究提供了氫氣在大鼠這種高等動物體內代謝的重要線索,應該成為氫氣生物醫學的最經典支持文獻。所有氫生物醫學研究者都應該認真閱讀學習。
 

該研究小組曾經用氚標記氫氣研究發現,進入身體內的氫氣能被腸道和土壤內常見細菌氧化為水進入有機體。研究有助于理解氚進入環境的途徑,也說明氚標記研究微量氫氣在生物體系代謝的可行性。氫氣參與生物氫化反應,但受檢測技術限制,濃度必需在較高情況下才能分析(50年代的檢測水平)。但比較明確的是,氫氣是某些酶催化反應的特異性抑制劑(見1950年Stephenson Marjory主編Bacterial metabolism第三版)。因為有許多因素不支持氫氣直接參與生化反應過程,因此需要對氚的生化過程進行確定性研究。氚標記技術給氫氣的痕量分析提供了研究可行性。
 

這一研究是用痕量氚氣分析方法研究氫氣能否在哺乳動物體內被氧化固定。由于腸道內細菌是動物體內氫氣代謝的重要因素,所以腸道組織作為被觀察目標之一。研究有三方面內容,1)腸道細菌代謝氫氣的作用。從腸道內分離出細菌,觀察對氚氣氧化的作用。2)組織勻漿對氫氣的氧化作用。各種哺乳動物組織勻漿對氚氣的氧化作用。3)整體動物研究不同組織對氫氣的氧化作用。把動物暴露在氚氣環境下,分析不同組織氚標記量,確定組織對氚氣的固定作用。
 

研究方法
 

本研究氚暴露四種情況:腸道細菌暴露,大鼠組織暴露,肺呼吸含氚氣體暴露,整體動物含氚氣體暴露。后面是具體方法,僅供專業人員閱讀。
 

細菌從腸道內分離,采用標準細菌學程序確定類型。制備細菌懸液,暴露在氚氣條件下,分析氚標記活性。
 

哺乳動物組織勻漿用0.1M磷酸緩沖液pH7.5稀釋為5%。在無菌條件下采集組織,在制備勻漿和氚暴露過程都持續保持無菌條件。暴露最后所有勻漿都進行細菌污染的檢測。只有細菌檢測陰性的組織勻漿才符合要求。動物組織勻漿的暴露實驗設施和細菌暴露實驗類似。經過暴露后,組織用干燥箱60°C真空干燥24小時。干燥樣品進行燃燒,分析干燥蒸發的水內氚活性。其他部分在10度條件下真空蒸發,采集水分進行放射性分析。
 

整體動物氚固定比例研究使用大鼠,將動物暴露在含有氚氣的裝置內(圖1是吸入和圖2是整體暴露)。

哺乳動物代謝氫氣的同位素研究證據!

圖1 通過呼吸暴露氚氣裝置。
 

該裝置整體為閉合系統,含有5個部分。分別為氚泵(A)、干燥管(B1,B2和B3),有連續記錄裝置的電離艙(C, D, E),一個雙向閥連接的氣管插管(G和H)、一個二氧化碳吸收艙(I)和氧氣注入口(J)。(不理解的是,氚泵的工作原理,如何保持氧氣進入系統內。)
 

氚泵的設計是下部瓶內氚用上部瓶內水進行替換,水下流進入下瓶,氚氣進入上瓶。當上部瓶水全部流下,進行上下轉換,重復上一程序。氣體在B1干燥管干燥,干燥劑為高氯酸鎂。(無水高氯酸鎂,呈白色多孔顆粒,具有強烈的吸水性,是碳、硫、氫、氧、氮等氣體分析儀器的理想干燥劑。)
 

干燥后的氣體經過電離艙(C)耦合微微安培計(D)和Esterline-Angus圖表記錄器(E)。隨后進入另外一個干燥管(B2)和雙向閥(G),這一裝置能讓實驗動物安需吸入管路內氣體。壓力計(F1和F2)在雙向閥兩側,能觀察氣壓在動物呼吸過程中的波動。動物呼出的氣體經過干燥管(B3)和二氧化碳吸收艙(I)凈化。從注氧空(J)注射氧氣補充因二氧化碳吸收導致的氣體缺口,經過管路輸入氣體艙的上部瓶內(A)。
 

動物用戊巴比妥鈉麻醉后氣管插管。用上述裝置經過完全氚氣暴露后,處死動物用絞肉機把動物絞碎,組織放在250毫升25% KOH溶液搖晃4小時,這個過程收集釋放出的氣體經過微燃燒裝置,燃燒后的水分析氚含量計算溶解在組織內的氚氣。進入燃燒裝置前,氣體先通過一個干冰把氚水冷凝。
 

0.5%氫氣和99.5%氧氣混合氣用于攜帶氚氣進入燃燒裝置,KOH消化組織內氚代表身體水和有機物內氚化合物含量。
 

動物整體暴露裝置也是一個密閉系統,其中經過動物呼吸過的氣體進行持續循環凈化,氚氣水平和氣壓維持穩定(圖2)。
 

氚氣從采樣球(A)進入系統(B)。經過樣本管的氣體經過干冰脫水(C)脫水銀蒸汽。氣體通過氣密循環泵(D)輸入到電離艙,這里有Beckman微微安培計和Esterline-Angus表記錄儀(我理解類似打印機)。這個組件能測定循環系統中氚的水平。此后氣體經過另一個干冰除水裝置(C),氣體進入暴露艙前進行壓力測定。
 

暴露艙是一個璐彩特(聚甲基丙烯酸甲酯)盒,完全浸在在25°C恒溫水中。排除氣體通入二氧化碳吸收管,經過飽和氫氧化鉀棉球清除動物呼吸產生的二氧化碳,然后氣體通過兩個高氯酸鎂干燥艙干燥處理,通過給系統補充氧氣和氚氣,維持穩定的氣壓和氚含量,泵系統足夠在幾分鐘內完成氣體完全循環。
 

暴露結束后用空氣沖洗系統大約20分鐘。此時氚分析顯示沒有氚氣存在于系統內。將動物取出后處死。動物組織勻漿后用Bidwell-Sterling進行苯蒸餾。蒸餾后成分用真空干燥去除苯和水分。樣本進行焚燒,產生的水進行氚含量分析代表有機物結合氚。苯蒸餾出的水和石油混合去除苯,水層離心分離后測定氚,代表身體中水的氚含量。

哺乳動物代謝氫氣的同位素研究證據!

圖2 整體動物氚氣暴露艙。
 

研究結果
 

腸道細菌固定氚氣為氧化氚(水)的能力很強,這和過去研究結果一致,說明研究方法穩定性好。研究中發現乳酸糞鏈球菌Streptococcus faecalis氧化氫氣的能力很強,這也是著名的腸道有益菌。
 

(放射性活度是指放射性元素或同位素每秒衰變的原子數,目前放射性活度的國際單位為貝克勒(Bq),也就是每秒有一個原子衰變。放射性活度的國際單位制單位是貝可勒爾(Bq),常用單位是居里(Ci)。1Ci=37GBq)
 

這里研究發現氚被氧化固定比例低于1%,各種組織勻漿氧化固定氚的比例見。
 

哺乳動物代謝氫氣的同位素研究證據!

表1 不同組織勻漿固定氚的能力。(重點)
 

顯然大場組織由于存在細菌,代謝能力超強。其他組織一般都沒有氧化氚的能力,但是脾臟的氧化固定能力非常強,達到了大腸的6%左右。經典的觀點認為哺乳動物組織并沒有代謝氫氣的作用,這樣高比例的代謝必須引起我們足夠的關注。小腸、腎臟和肌肉也有相對強的代謝能力,而脂肪、大腦和肝臟等作用幾乎可以忽略不計了。這個研究再次證明,大腸內細菌是代謝利用氫氣的最主要部位。
 

哺乳動物代謝氫氣的同位素研究證據!

表2.消化道切除對氚標記的影響。
 

為了進一步驗證大腸細菌是固定利用氫氣最重要部位的假說。研究進一步采樣整體動物進行實驗。通過氣管插管給動物吸入含氚氣空氣,有正常動物,也有切除胃腸道的動物(厲害!),研究結果見表2. 全身暴露和肺呼吸暴露的無明顯差別,預先3天口服抗生素會產生明顯影響(表3)。
 

討論
 

過去研究發現,含有氫化酶的細菌能氧化環境中痕量氚氣分子為氧化氚(氚水)。由于氚濃度非常低,放射劑量比較小,放射損傷不足以影響細菌的正常代謝。氚濃度是最重要的反應速度影響因素。因為放射性檢測敏感性高,這些研究能用氚測定能研究其變化,但同樣變化的氫氣和氘氣因為檢測信號敏感度因素而無法檢測氘。
 

正常情況下大鼠腸道內細菌具有氧化氚氣的能力,這一研究結果發現,腸道內不同種群的細菌氧化氚氣的能力有較大差異。研究結果在表1中。這一結果也說明,腸道細菌是氧化氚的主要因素。在脾臟內出現比較大的氧化代謝,這無法用細菌代謝來解釋,也無法給出合理的解釋。雖然許多動物組織在制備過程會受到細菌污染,在比較短時間細菌可以大量繁殖。本研究似乎難以用細菌污染來解釋,例如大腸桿菌和普通變形桿菌是最常見的腸道微生物,但假單胞菌是脾臟組織中常見的污染菌。更重要的是,脾臟組織勻漿中細菌的數量很少,也不足以影響氚的氧化固定。一般情況下,動物組織勻漿中細菌無法檢測到,氚固定也非常低。這些結果都有可能受到氫氚物理交換反應的影響。
 

整體動物插管吸入氚氣的結果見表2。腸道切除手術對氚保留的顯著影響再次證明動物腸道細菌是固定氚的主要因素。實驗結果發現存在明顯的個體差異,原因可能是本研究沒有選擇在品種、體重和年齡完全一致的實驗動物,這些動物的腸道菌群存在比較大的差別(那個時候的實驗要求和現在很不一樣?)。但是消化道切除手術的動物仍然都出現了一致的改變。這更符合腸道菌群是動物氧化固定氚氣的主要因素這個假設。
 

切除胃腸道的動物,大腸內細菌顯然也會被去除。關于腸道菌固定氚的推論也有更進一步的證據見表3。
 

哺乳動物代謝氫氣的同位素研究證據!

表3 抗生素對動物固定氚能力的影響。
 

采用抗生素處理可影響腸道菌的增殖和代謝。本研究發現,暴露氚氣前用抗生素處理,能顯著抑制氚固定數量,這從另一個方面證明腸道菌群在氚固定中的重要地位。
 

但是細菌數量的下降和氚固定的改變沒有明顯的相關關系,使用抗生素可將動物大便中細菌數量降低到正常值的1%,但氚固定減少的比例只有50%左右。數量和種類都是影響氚固定的重要因素,所以單純細菌計數不能直接反應能固定氚的細菌類型。
 

本研究雖然證明腸道菌是代謝氫氣的重要因素,但是并不能否定哺乳動物細胞本身能代謝氫氣,尤其是發現抗生素處理大幅度抑制細菌后氚標記仍然保留50%。腸道切除后仍然存在有3%的氚標記存在。更直接的研究證據是發現脾臟能大量氧化固定氚氣,而小腸組織,腎臟,心臟、肌肉和大腦也具有比較強的固定能力。顯著超過肝臟、胃、皮膚和脂肪固定氚的能力。